多癌种的同时精准诊断不仅是“查全”“查早”的技术升级，更是从“单一疾病管理”向“整体健康维护”的理念转变。它通过整合多维度检测手段、优化临床决策路径，在提升患者生存质量、降低医疗负担的同时，为肿瘤学研究提供了跨疾病的创新视角，是精准医学在癌症领域落地的重要方向。
针对此目标，2025 年 7 月 10 日，上海市第十人民医院朱小立教授、沈兵教授、李文星博士团队合作在Chem期刊上发表了题为“Enzymatic DNA Orthogonal Chemistry for Multi-Cancer Diagnosis”的研究论文。研究团队将创新试剂与先进设备相融合，在国际上首次开发了基于酶促 DNA 正交化学的多重正交检测平台（EzDo-CRAFT）。该平台将切刻内切酶所提供的正交信号输出与激发-发射荧光光谱矩阵（EEM）的荧光信号超分辨能力相结合，通过对临床尿液样本中 10 种尿液外泌体来源肿瘤标志物进行一锅式检测，成功实现了对膀胱癌、前列腺癌、肾癌三种泌尿系统常见肿瘤的同步筛查。EzDo-CRAFT 平台能够在单管内实现多靶标的正交检测，为液体活检提供了技术借鉴。
论文通讯作者是朱小立、沈兵、李文星；第一作者是毛东升、勾泓荃。
图1：基于酶促 DNA 正交化学的三维光谱指纹检测平台示意图。
EzDo-CRAFT 平台整合切刻内切酶 Nt.BstNBI 与 EEM 技术，突破现有通量限制，实现多靶标一锅式检测及正交信号输出。Nt.BstNBI 能特异性识别并切割完全匹配的双链 DNA（Reporter/Code），其切割活性受碱基错配显著抑制（图 1A,B），展现出正交识别潜力。结合 EEM 采集三维荧光光谱指纹（激发/发射波长-强度），可实现多重靶标信号的可视化检测（图 1C）。平台成功应用于泌尿系统肿瘤诊断，通过检测尿液中 10 种外泌体 RNA，构建分类模型可区分膀胱癌、前列腺癌、肾癌及健康人群（图 1D）。
图2：基于 Nt.BstNBI 的酶促 DNA 正交化学验证。
研究发现，Nt.BstNBI 可对不同可变区的 Reporter/Code 序列进行高效切割（图 2A），但 Code 链引入碱基错配后，切割效率显著降低（图 2B-G）。表明 Nt.BstNBI 对识别区碱基错配敏感，具有 DNA 序列特异的正交潜力。
图3：计算机辅助设计的正交 DNA 文库验证酶促正交化学。
作者开发了基于 Java 的交互式 DNA 序列设计平台，可快速生成满足相似度、二聚化可能等要求的正交 DNA 文库（图 3A）。统计发现可变区第 4 位G和第 5 位A被发现可能抑制切割效率（图 3B-C）。大规模测试证明序列间正交性良好，并且其正交性仅与错配碱基数相关，而与 Tm 值无关（图 3D-F）。该研究首次系统验证了 Nt.BstNBI 的正交切割稳健性，为其在多重检测中的应用奠定了基础。
图4：EzDo-CRAFT 平台的验证。
作者进一步采用 EEM 技术构建“三维光谱指纹”，实现了 10 种荧光信号的准确区分，有效解决了多重荧光检测中的光谱重叠问题（图 4A-C），且 EzDo-CRAFT 体系相比 CRISPR-Cas12a 体系具有更高的荧光信号释放选择性，更适合进行多重检测（图 4D）。结合 LATE-PCR 技术，系统检测限达 0.19-0.55fM（图 4E-H），展现出优异的多重检测灵敏度和定量能力。
图5：EzDo-CRAFT 用于细胞系区分。
作者以 PC-3（前列腺癌）和 HeLa（宫颈癌）细胞为癌症模型，筛选了 8 种特异性 RNA 标志物进行验证（图 5A-B）。EzDo-CRAFT 检测结果与 qPCR 高度一致，能有效区分不同细胞系（图 5C-E）。通过N-PLS 模型分析 27 个模拟样本，系统可准确区分三类模拟样本（图 5F-H）。
图6：使用 EzDo-CRAFT 进行多癌种同步诊断。
最后，EzDo-CRAFT 平台被应用于实现三种泌尿系统常见肿瘤（膀胱癌、前列腺癌、肾癌）的无创鉴别（图 6A）。实验显示三维光谱指纹可清晰区分各类肿瘤样本（图 6C），N-PLS 模型对三种癌种鉴别准确率达 82.5%，优于 qPCR（图 6D-F）。该技术突破了传统单管式荧光检测的通量，展现出了 EzDo-CRAFT 在临床多重液体活检中的广泛适用性。
随着精准医疗的发展，临床对于检测技术的高通量、高灵敏、高特异性的信息获取提出更高要求。作者所提出的 EzDo-CRAFT 平台，整合了酶促反应与三维光谱指纹，实现了靶标识别与信号输出的高度正交化，在不依赖固相界面的条件下实现单管多靶标同步检测。平台克服了现有试剂难以兼顾正交识别与正交信号输出的局限，提升了检测通量、灵敏度与稳定性。EzDo-CRAFT 除了在细胞分型、癌症诊断中的出色区分表现，通过单管同步检测还可降低批次效应所带来的误差，更易于结果的标准化。此外，平台还具备可拓展性，支持复杂场景下的多重检测，并可结合光谱拆分更进一步提升通量。综上所述，EzDo-CRAFT 在多靶标精准检测方面的出色能力，有望革新现有的诊断方式，并拓展在多种生物医学领域的应用。（来源：科学网）
